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May 17, 2024

Transcription inversée

Scientific Reports volume 13, Numéro d'article : 11470 (2023) Citer cet article 9845 Accès à 4 détails de Altmetric Metrics La procédure illustrée dans cet article représente une nouvelle méthode de transcriptome

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 11470 (2023) Citer cet article

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La procédure illustrée dans cet article représente une nouvelle méthode d’analyse du transcriptome par PCR (Polymerase Chain Reaction), qui évite la nécessité d’éliminer une contamination potentielle de l’ADN. Par rapport aux méthodologies existantes, notre méthode est plus précise, plus simple et plus reproductible car elle préserve l'intégrité de l'ARN, ne nécessite pas de matériel et/ou de réactifs utilisés pour l'élimination de l'ADN et réduit également le nombre d'échantillons à prélever. comme contrôles négatifs. Cette nouvelle procédure implique l'utilisation d'une amorce spécifiquement modifiée lors de l'étape de transcription inverse, qui contient des bases mésappariées, produisant ainsi des molécules d'ADNc différentes de l'ADN génomique. En utilisant la même amorce modifiée dans l’amplification PCR, seule la matrice d’ADNc est amplifiée puisque la matrice d’ADN génomique est partiellement hétérologue à l’amorce. De cette manière, l’amplification par PCR n’est affectée par aucune contamination potentielle de l’ADN puisqu’elle est spécifique uniquement de la matrice d’ADNc. De plus, il reflète avec précision la concentration initiale d’ARN de l’échantillon, qui est sujette à des changements dus à divers traitements physiques ou enzymatiques couramment utilisés par les méthodologies actuelles d’élimination de l’ADN. La méthode est particulièrement adaptée à la quantification de transcrits d’ADN hautement répétitifs, tels que l’ADN satellite.

L’analyse qualitative et/ou quantitative des transcrits par amplification PCR est une méthode de choix aussi bien en recherche en biologie moléculaire qu’en diagnostic médical1. Il est largement utilisé pour détecter et quantifier de nombreux types différents de transcrits tels que l'ARN messager, l'ARN ribosomal, l'ARN non codant, etc. Les applications les plus courantes incluent l'analyse de l'expression génique et l'identification précise d'un micro-organisme particulier.

Afin d'être correctement analysé, l'ARN purifié est soumis à une étape préliminaire et fondamentale de transcription inverse, par laquelle les molécules d'ARN sont converties en ADNc (ADN complémentaire) par l'enzyme transcriptase inverse. En effet, l’ARN lui-même ne peut pas être directement amplifié lors des étapes ultérieures de PCR et doit nécessairement être converti en ADNc1. Le principal problème de la plupart des protocoles actuellement utilisés réside dans la contamination fréquente de l'ADN, qui est impossible à différencier chimiquement au niveau structurel de l'ADNc par l'enzyme polymérase lors de l'amplification PCR, provoquant ainsi des résultats faussement positifs2,3,4,5, 6,7. Afin de surmonter cette limitation, tous les protocoles actuels incluent quelques étapes d’élimination de l’ADN, à la fois lors de la purification de l’ARN et lors de l’étape de transcription inverse ultérieure. Dans les deux cas, l'ADN serait éliminé, soit à l'aide de filtres mécaniques spécifiques (colonnes à base de silice), soit par digestion enzymatique par une enzyme spécifique, comme la DNase I (Désoxyribonucléase I)8. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces à 100 % pour éliminer l’ADN, qui reste souvent sous forme de contamination par l’ADN2,3. C'est particulièrement le cas de l'ADN hautement répétitif qui constitue une partie substantielle du génome eucaryote et est souvent transcrit à de faibles niveaux. Par ailleurs, il convient de souligner que toute procédure mise en œuvre pour réduire la concentration d'ADN dans l'échantillon entraîne certainement également la réduction de la concentration initiale de l'ARN lui-même, molécule qui est par nature instable et facilement dégradable.

Nous rapportons ici une nouvelle méthode d'analyse du transcriptome par PCR, dans laquelle l'ADNc et l'ADN sont différenciés et ainsi la contamination par ce dernier est exclue, produisant ainsi des résultats plus précis, fiables et reproductibles.

Les amorces directes, inverses et modifiées utilisées pour tester le nouveau protocole sont illustrées dans le tableau 1. L'amorce spécifique modifiée diffère par rapport aux amorces directes et inverses non modifiées par seulement quatre altérations de bases (mutations ponctuelles) distribuées alternativement avec des nucléotides inchangés et à partir du Extrémité 3' de l'amorce (marquée en gras dans le tableau 1).